CAR-T發展過程中，科學家利用基因工程的魔法，不斷優化改造T細胞，增加其實效性、持續性、安全性、通用性等。以簡單快捷的CRISPR為代表的基因編輯技術的崛起，也提供了改造T細胞的新思路，在CAR-T療法中逐漸展露鋒芒。
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什么是CAR-T細胞？嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T療法）作為細胞治療中的臨床療效耀眼的佼佼者，通過對T細胞進行基因工程修飾，使其表達CAR，從而獨立于MHC呈遞，特異性識別腫瘤抗原，最終激活T細胞并介導癌細胞的殺傷。
CAR-T細胞療法在包括侵襲性B細胞淋巴瘤為代表的血液惡性腫瘤治療中表現突出。2017年8月，美國食品和藥物管理局（FDA）首次正式批準針對CD19的CAR-T細胞療法Kymriah上市，該療法在治療侵襲性急性淋巴細胞白血病中，約76％的患者完全緩解[1-2]。
CAR-T細胞進階史1989年，第一代CAR-T只有一個胞內信號傳導結構域（主要是CD-3ζ或FcRγ），僅在T細胞表達單鏈抗體，靶向腫瘤細胞表面抗原分子，但存續時間短，限制了其發揮功效[3]。
第二、三代，將共刺激信號分子（CD28、4-1BB等）組裝進CAR，提升T細胞活化、存續和擴增[4]。第四代CAR-T追加引入促炎細胞因子（IL-12等），在具有免疫抑制性的腫瘤微環境中，通過釋放促炎因子招募并活化更多免疫細胞，引起更廣泛的抗腫瘤免疫效應。第五代通用型CAR-T通過敲除異體T細胞可能造成免疫排斥的基因，為CAR-T療法的大規模生產和即時應用提供了可能。
基于病毒轉染技術的CAR-T生產傳統技術路線中，通過慢病毒載體（LV）將CAR序列轉染進T細胞，從而進行基因組整合，獲取CAR-T細胞，這種方法可確保CAR構造的有效整合和穩定表達。然而，在CAR-T細胞生成中使用病毒載體，存在CAR序列可能產生隨機基因組整合的缺點，例如潛在的插入突變、異種CAR表達、CAR表達沉默[5-6]。
同時，病毒轉染技術操作復雜、成本高、周期長，增加了CAR-T療法造價和時間成本，限制了后續CAR-T療法臨床普及應用。
新方法！利用CRISPR靶向插入CARCRISPR/Cas9為CAR結構靶向特定目標基因提供新思路。CRISPR核糖核蛋白復合物由gRNA和Cas9蛋白組成，gRNA中tracrRNA部分與Cas9結合，crRNA部分可識別特定的目標序列，并通過Cas9對目標序列進行剪切。剪切產生雙鏈斷裂后，細胞修復機制被激活，可通過非同源末端連接（NHEJ）實現基因敲除，或通過同源性定向重組（HDR），同時加入同源模板實現基因敲入。科學家通過HDR實現長片段DNA序列的靶向插入，并運用于CAR-T細胞的生產。例如，Eyquem etal.利用CRISPR/Cas9（Cas9 mRNA和gRNA）將特異性識別CD19 的CAR，靶向地插入TRAC（編碼TCRα鏈）基因座[7]。該應用中， CD19-CAR DNA供體模板通過免疫原性、整合風險更低的腺相關病毒（AAV6）載體遞送進T細胞，從而可以規避上述慢病毒載體可能存在的風險。
近期，medRxiv預印本中，Zhang等針對AAVS1安全位點和PD1這兩個基因位點，利用CRISPR/Cas9成功開發了CAR-T細胞。該研究中使用了金斯瑞合成的gRNA。Zhang等將非病毒的CAR的DNA模板（包含CD19抗原識別結構域、4-1BB-CD3ζ信號結構域（19bbz）），通過CRISPR/Cas9靶向插入AAV1基因座，由此生產的CAR-T細胞，與原慢病毒轉染模式生產的CAR-T細胞相比，具備類似的擴增能力和腫瘤殺傷能力。同樣的，通過類似的CRISPR/Cas9技術，生產包含識別PD1的CAR的T細胞，與原慢病毒轉染模式生產的CAR-T細胞相比，zz，更節省時間與經費成本。接下來，另一項臨床試驗（NCT04213469）旨在評估利用CRISPR/ Cas9技術生產的、靶向PD1的CAR-T細胞在治療復發/難治性（r/r）侵襲性B細胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）的安全性和有效性。Zhang等通過電轉的方式將核糖核蛋白復合物（spCas9 / PD1-crRNA：tracrRNA）和非病毒CAR DNA模板，轉入從患者獲取的T細胞。用該方法獲得的PD1-19bbz CAR-T細胞治療沒有細胞因子釋放綜合癥和神經毒性在內的嚴重不良事件，并使兩名代表性患者在接受3個月治療后完全緩解[6]。目前，CRISPR/Cas9基因編輯系統在自體和同種異體CAR-T細胞的開發中的應用發展迅猛，為基于非病毒敲入策略，進行CAR-T細胞基因編輯提供了安全有效的方案。
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