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穩定細胞系用于分析 在研究中被廣泛使用,作為發現新途徑的工具,或用于發現治療方法。細胞基礎分析的開發需要一個經過驗證表達感興趣基因的單克隆穩定細胞系。金斯瑞能夠使用我們基于慢病毒的平臺細胞系開發,開發具有難以轉染的細胞和高表達難以表達基因的重組穩定細胞系。金斯瑞也可以使用非慢病毒方法開發穩定細胞系。以下是一些基于應用的案例研究,展示了金斯瑞開發的穩定細胞系。

案例分析:產生一個抗凋亡細胞系,以提高對遺傳毒性的篩選。

通過流式細胞術檢測微核,可以對非整倍體和染色體破裂原進行遺傳毒性篩選。然而,由于細胞毒性引起的凋亡體的存在,而非遺傳毒性,這種類型的分析往往會產生假陽性結果。

為了克服假陽性結果,一家大型制藥公司的科學家們開發了一種更健壯的分析方法,通過在FACS基礎的微核分析中使用一個抗凋亡的穩定細胞系(在TK6細胞中過表達BCL-xL)。此外,還評估了非整倍體標記物磷酸化組蛋白H3(H3)和雙鏈斷裂標記物γH2AXser139(γH2AX DSB)的存在,以進一步驗證引起微核的化合物。

金斯瑞的基于慢病毒的穩定細胞系服務成功提供了關鍵的重組穩定細胞系,用于開發這種高度特異的遺傳毒性分析。

產生抗凋亡穩定細胞系

TK6 Bcl-xL單穩定克隆的qPCR和Western blot驗證

qPCR分析顯示穩定克隆中BCL-xL的mRNA表達高于未轉染的對照組。

通過Western blot確認了單個穩定細胞中BCL-xL的蛋白表達

Clastogen (Etoposide) Aneugen (Vinblastine) Cytotoxicant (Tunicamycin)
Micronucleus/
toxicity profile
H3-P (Aneugen marker) profile

上述數據顯示,野生型和BCL-xL過表達的TK6細胞系在細胞生長和毒性方面表現出相似的水平。此外,與野生型相比,TK6-BCL-xL表現出更少的凋亡體。BCL-xL細胞系對斷裂原(依托泊苷)和非整倍體原(長春堿)產生了陽性反應,但對細胞毒性物質(吐尼卡霉素)沒有產生陽性反應。此外,斷裂原顯示出γH2aX DSB水平升高,而非整倍體原顯示出H3-P水平升高,細胞毒性物質則沒有使γH2aXDSB或H3-P水平升高。

Richard A. Spellman, et al., "Strategies to Avoid Misleading Positives and to Identify Genotoxic Mechanisms in the Flow Cytometric In Vitro Micronucleus Assay in TK6 Cells" (poster presentation, 2014 Annual Genetic Toxicology Association Meeting, Newark, DE, May 7-8, 2014), accessed September 4, 2014 http://www.gta-us.org/scimtgs/2014Meeting/posters2014.html#poster1

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